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非洲豬瘟病毒熒光PCR快速檢測試劑盒說明書

                                       獸用

【獸藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR快速檢測試劑盒

商品名稱：無

漢語拼音：Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Kuaisu Jiance Shijihe

英文名稱：Real-time PCR for Rapid Detection of African Swine Fever Virus

【主要成分與含量】

【作用與用途】本試劑盒適用于豬血液、豬肉組織、淋巴結(jié)、脾臟等樣本中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

【用法與判定】

1 用法

1.1 樣品處理及模板準備

1.1.1 樣品處理

·組織樣品處理：分別從豬肉組織、淋巴結(jié)、脾臟不同位置取樣，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.1g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml無菌離心管，12000 r/min離心2分鐘，取上清200μl備用。

·血液樣品無需處理，取200μl備用。

1.1.2 模板準備

·根據(jù)不同的樣本類型，按照下表準備相應的樣本用量。

·將樣本加入到1.5 ml離心管中，加入下表推薦體積的Solution A，渦旋震蕩20 s，并按照下表推薦的處理方法，室溫靜置3-5 min，或95℃金屬浴振蕩孵育3-5 min。

·樣本充分裂解后（95℃金屬浴振蕩孵育的樣本需恢復室溫），加入下表推薦體積的Solution B，并渦旋震蕩30 s，12000rpm離心2min，上清即為模板DNA。

·處理后的樣本如在2小時內(nèi)進行下一步試驗，請于4℃保存，如不能立即進行下一步試驗，請于-20℃保存。

備注：組織樣本加入10倍體積的生理鹽水制成組織勻漿液后，可按照血液樣本的處理方法進行處理。

1.1.3可利用商品化試劑盒提取核酸進行反應，效果更佳

1.2 熒光PCR擴增

1.2.1 試劑準備

實驗前20分鐘將試劑從冰箱取出并恢復至室溫，使其*融化，充分混勻后瞬時離心去除管壁吸附液體。

1.2.2 配制反應體系

按下表1體系，在配套PCR管中配制反應體系，蓋緊管蓋后瞬時離心10秒，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。

表1  PCR反應體系

1.2.3 PCR擴增

快速模式

表2 儀器PCR擴增參數(shù)

2 判定

2.1 合理調(diào)整閾值線，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整。

2.2 試劑盒有效性判定

·陰性對照：無Ct值，線形為直線或微斜，無明顯指數(shù)增長。

·陽性對照：Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的S型曲線。

2.3 樣本結(jié)果判定

·樣本檢測結(jié)果Ct值≤38，有明顯指數(shù)增長，判定為陽性，表明樣本中檢測出非洲豬瘟病毒。

·樣本檢測結(jié)果38＜Ct≤40，判定為可疑。應對樣本進行復測，若復測結(jié)果Ct值仍在38~40之間，有明顯指數(shù)增長，則判定為陽性，否則為陰性。

·樣本檢測結(jié)果無Ct值，判定為陰性，表明樣本中未檢測出非洲豬瘟病毒。

【注意事項】

（1）實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴格按步驟執(zhí)行，不使用本試劑盒提供的組份或不按照說明書進行實驗可能導致錯誤結(jié)果。

（2）所有試劑應在規(guī)定溫度儲存。-20℃保存的試劑在使用前應充分混勻。試劑盒反復凍融次數(shù)不宜超過5次。

（3）實驗操作應按照國家有關(guān)臨床基因擴增實驗室管理規(guī)范執(zhí)行，實驗過程應分區(qū)（試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)），各區(qū)物品為，不得交叉使用，避免污染。

（4）操作臺、移液器、離心機等儀器用品應經(jīng)常用1%次氯酸鈉、75%乙醇或紫外燈進行消毒。耗材應進行無酶處理。

（5）待檢樣本、試劑盒組份及實驗中的廢棄物需按照具有潛在傳染性物質(zhì)處理方法進行處理。

（6）為防止熒光干擾，應避免使用含熒光物質(zhì)的手套，避免用手直接接觸，預防交叉污染。

（7）檢測結(jié)果為陰性，并不*代表為非感染狀態(tài)，具體診斷需結(jié)合獸醫(yī)臨床。

（8）產(chǎn)生假陰性的可能原因為：待檢樣本在采集、運輸、保存及核酸提取過程中操作不當造成DNA降解；樣本中核酸濃度低于低檢測限；病毒待測靶基因出現(xiàn)變異；未經(jīng)驗證的其他干擾因素。

（9）產(chǎn)生假陽性的可能原因為：待檢樣本采集、運輸及核酸提取過程中發(fā)生交叉污染。

【規(guī)格】 50反應/盒

【貯藏及有效期】 試劑盒-20℃以下冷凍避光保存，有效期為12個月。

【生產(chǎn)企業(yè)】 廣州悅洋生物技術(shù)有限公司

僅供獸醫(yī)診斷使用